Разрешающая способность и полезное увеличение это
Микроскоп предназначен для наблюдения мелких объектов с большим увеличением и с большей разрешающей способностью, чем дает лупа. Оптическая система микроскопа состоит из двух частей:
объектива и окуляра. Объектив микроскопа образует действительное увеличенное обратное изображение предмета в передней фокальной плоскости окуляра. Окуляр действует как лупа и образует мнимое изображение
на расстоянии наилучшего видения (рис. 6.4). По отношению ко всему микроскопу рассматриваемый предмет располагается в передней фокальной плоскости.
Рис. 6.4. Оптическая схема микроскопа.
6.2.1. Увеличение микроскопа
Действие микрообъектива характеризуют его линейным увеличением:
| , | (6.5) |
где – фокусное расстояние микрообъектива, – расстояние между задним фокусом объектива и передним фокусом окуляра, называемое оптическим интервалом или оптической длиной тубуса.
Изображение, создаваемое объективом микроскопа в передней фокальной плоскости окуляра рассматривается через окуляр, который действует как лупа с видимым увеличением:
| . | (6.6) |
Общее увеличение микроскопа определяется как произведение увеличения объектива на увеличение окуляра:
. | (6.7) |
Если известно фокусное расстояние всего микроскопа, то его видимое увеличение можно определить так же, как и у лупы:
| . | (6.8) |
Как правило, увеличение современных объективов микроскопов стандартизованное и составляет ряд чисел: 10, 20, 40, 60, 90, 100 крат. Увеличения окуляров тоже имеют вполне определенные
значения, например 10, 20, 30 крат. Во всех современных микроскопах имеется комплект объективов и окуляров, которые специально рассчитываются и изготавливаются так, что подходят друг к другу, поэтому
их можно комбинировать для получения разных увеличений.
6.2.2. Поле зрения микроскопа
Поле зрения микроскопа зависит от углового поля окуляра , в пределах которого получается изображение достаточно хорошего качества:
| . | (6.9) |
При данном угловом поле окуляра линейное поле микроскопа в пространстве предметов тем меньше, чем больше его видимое увеличение.
6.2.3. Диаметр выходного зрачка
микроскопа
Диаметр выходного зрачка микроскопа вычисляется следующим образом:
| . | (6.10) |
где – передняя апертура микроскопа.
Диаметр выходного зрачка микроскопа обычно немного меньше диаметра зрачка глаза (0.5 – 1 мм).
При наблюдении в микроскоп зрачок глаза нужно совмещать с выходным зрачком микроскопа.
6.2.4. Разрешающая способность
микроскопа
Одной из важнейших характеристик микроскопа является его разрешающая способность. Согласно дифракционной теории Аббе, линейный предел разрешения микроскопа, то есть минимальное
расстояние между точками предмета, которые изображаются как раздельные, зависит от длины волны и числовой апертуры микроскопа:
| . | (6.11) |
Предельно достижимую разрешающую способность оптического микроскопа можно сосчитать, исходя из выражения для апертуры микроскопа (). Если учесть, что максимально возможное значение синуса угла – единичное (), то для средней длины волны можно вычислить разрешающую способность микроскопа: .
Из выражения (6.11) следует, что повысить разрешающую способность микроскопа можно двумя способами: либо увеличивая апертуру объектива, либо уменьшая длину волны света, освещающего
препарат.
Иммерсия
Для того чтобы увеличить апертуру объектива, пространство между рассматриваемым предметом и объективом заполняется так называемой иммерсионной жидкостью – прозрачным веществом
с показателем преломления больше единицы. В качестве такой жидкости используют воду (), кедровое масло (), раствор глицерина и другие вещества. Апертуры иммерсионных объективов большого увеличения достигают величины , тогда предельно достижимая разрешающая способность иммерсионного оптического микроскопа составит .
Применение ультрафиолетовых лучей
Для увеличения разрешающей способности микроскопа вторым способом применяются ультрафиолетовые лучи, длина волны которых меньше, чем у видимых лучей. При этом должна быть
использована специальная оптика, прозрачная для ультрафиолетового света. Поскольку человеческий глаз не воспринимает ультрафиолетовое излучение, необходимо либо прибегнуть к средствам, преобразующим
невидимое ультрафиолетовое изображение в видимое, либо фотографировать изображение в ультрафиолетовых лучах. При длине волны разрешающая способность микроскопа составит .
Кроме повышения разрешающей способности, у метода наблюдения в ультрафиолетовом свете есть и другие преимущества. Обычно живые объекты прозрачны в видимой области спектра, и поэтому перед
наблюдением их предварительно окрашивают. Но некоторые объекты (нуклеиновые кислоты, белки) имеют избирательное поглощение в ультрафиолетовой области спектра, благодаря чему они могут быть «видимы»
в ультрафиолетовом свете без окрашивания.
6.2.5. Полезное увеличение микроскопа
Глаз наблюдателя сможет воспринимать две точки как раздельные, если угловое расстояние между ними будет не меньше углового предела разрешения глаза. Для того чтобы глаз наблюдателя
мог полностью использовать разрешающую способность микроскопа, необходимо иметь соответствующее видимое увеличение.
Полезное увеличение – это видимое увеличение, при котором глаз наблюдателя будет полностью использовать разрешающую способность
микроскопа, то есть разрешающая способность микроскопа будет такая же, как и разрешающая способность глаза.
Если две точки в передней фокальной плоскости микроскопа расположены друг от друга на расстоянии , то угловое расстояние между изображениями этих точек . Из выражений (6.11) и (6.8) можно вывести видимое увеличение микроскопа:
| . | (6.12) |
Поскольку обычно диаметр выходного зрачка микроскопа около 0.5 – 1 мм, угловой предел разрешения глаза 2´ – 4´. Если взять среднюю длину волны в видимой области спектра
(0.5 мкм), то для полезного увеличения микроскопа можно вывести зависимость:
| . | (6.13) |
Микроскоп с видимым увеличением меньше 500А не позволяет различать глазом все тонкости структуры предмета, которые изображаются как раздельные данным объективом (). Использование видимого увеличения больше 1000А нецелесообразно, так как разрешающая способность объектива не позволяет полностью использовать
разрешающую способность глаза ().
Описание
Существующие в настоящее время стационарные офтальмоскопы обеспечивают увеличение в 25—30 раз, хотя конструкция этих приборов допускает применение значительно большего увеличения. Объясняется применение такого сравнительно невысокого увеличения физическими возможностями метода. В основном они связаны с дифракцией. В офтальмоскопах, как и в других оптических приборах, существует определенное увеличение, превышение которого бессмысленно и даже вредно. Оно лимитируется разрешающей способностью прибора — наименьшим расстоянием между двумя точками или линиями, которые данная система формирует раздельно. Увеличение, позволяющее рассмотреть эти линии, называется «полезным». Большее увеличение давать не следует, поскольку оно не только не способствует более подробному рассмотрению структуры, но может вызвать о ней ложное представление. При слишком большом увеличении мелкие детали видны в виде размытых пятен разной формы и с неправильным распределением света. Увеличение меньшее, чем полезное, не позволяет использовать разрешающую способность прибора, т. е. наблюдать те мелкие детали, которые четко формируются на изображении. Таким образом, оно должно соответствовать его разрешающей способности. Последняя является главным показателем возможностей прибора при исследовании структуры Рассмотрим, от чего зависит теоретическая разрешающая способность офтальмоскопов
Дифракция на зрачке глаза. Если система не имеет аберраций и других оптических недостатков, то ее разрешающая способность ограничивается дифракцией на краях отверстия, через которое проходит свет. Одна из основных трудностей, возникающих при офтальмоскопии, связана с малым размером зрачка исследуемого глаза Даже при медикаментозно расширенном для детального исследования глазного дна зрачке диаметр его не превышает 5—7, иногда 8 мм. Но, как указывалось в разделе 2.2, в целях получения безрефлексного изображения и этот размер используется не полностью, так как часть зрачка занята изображением источника света. Диаметр зоны, через которую ведется наблюдение, обычно не превышает 2—2,5 мм, а при стереоскопическом исследовании 1 мм.
Таким образом, очевидно, что относительное отверстие системы, формирующей изображение глазного дна, всегда мало, вследствие чего существенное значение приобретает дифракция.
Для оценки влияния дифракции рассмотрим с точки зрения волновой теории света процесс образования изображения глазного дна. При этом отвлечемся от способов его освещения и будем рассматривать поверхность глазного дна как самосветящуюся.
В простейшем случае пучки света ограничиваются зрачком глаза. Выходя из глаза, они дифрагируют на краях радужки и образуют в пространстве действительное изображение глазного дна. В более сложном случае, когда для устранения рефлексов от роговицы на зрачке глаза разделяют входной зрачок и изображение источника света, пучки ограничиваются не зрачком глаза, а апертурной диафрагмой, установленной внутри прибора. Дифракция, обусловливающая разрешение, происходит на краях диафрагмы, а значение апертурного угла и в пространстве изображений зависит не от диаметра зрачка глаза, а от величины выходного зрачка прибора. В обоих случаях каждая точка глазного дна изображается дифракционной фигурой, радиус главного максимума которой р вычисляют по формуле:
Зная радиус главного максимума, можно определить разрешение системы. Как известно, две точки считаются вполне разрешенными, если на их изображении между двумя дифракционными максимумами есть по крайней мере один минимум. Обычно в расчетах пользуются нижним пределом разрешения — таким расстоянием 8′ между точками изображения, при котором освещенность минимума дифракционной картины составляет примерно 80 % от максимальной освещенности. В этом случае 8′ равно радиусу главного максимума:
Чтобы определить фактическое расстояние 8 между деталями глазного дна, которые можно видеть раздельно, перейдем от пространства изображений к пространству объектов. После преобразований получаем:
где n — показатель преломления глазных сред.
Для «схематического глаза» по Гульстранду, в котором L принята равной примерно 24 мм, а n = 1,34, зависимость приобретает следующий вид:
Полученная зависимость показывает, что минимальная величина различаемого при офтальмоскопии объекта на глазном дне зависит от величины входного зрачка наблюдательной системы офтальмоскопа. Чтобы повысить разрешающую способность при офтальмоскопии, т. е. получить возможность рассмотреть более мелкие объекты, нужно было бы увеличить входной зрачок.
Однако вследствие неправильной формы роговицы входной зрачок офтальмоскопа не имеет смысла делать больше 2 мм, чтобы он не захватил периферической зоны роговицы, вносящей искажения в изображение глазного дна. Из этого следует, что даже теоретически, яз условий дифракции, минимальная величина разрешаемого при офтальмоскопии объекта не может быть менее 5—7 мкм, что составляет 140/200 линий на 1 мм.
В стереоскопических приборах с диаметрами зрачков входа 1 мм теоретическая разрешающая сила не превышает 10 мкм (100 линий на 1 мм). В реальных условиях разрешающая способность еще ниже.
Полезное увеличение при офтальмоскопии. Зная минимальное расстояние между точками на глазном дне, которые еще могут быть видны раздельно при данной величине входного зрачка, можно найти полезное увеличение прибора.
Поскольку изображение формируется офтальмоскопом совместно с оптической системой исследуемого глаза, обе эти системы рассматриваются как одна микроскопическая система глаз—офтальмоскоп.
Видимым увеличением Г будем считать, как обычно, отношение:
Чтобы наблюдатель использовал полностью разрешающую силу системы, отрезок б должен быть виден под углом, соответствующим остроте зрения наблюдателя. Приняв остроту зрения врача, подставляем в формулу величину у’ и получаем:
В этой формуле числовой коэффициент имеет размерность, и величину d необходимо выражать в миллиметрах. Для d=2 мм полезное увеличение =30.
Использование полезного увеличения в приборах разных типов. Увеличение такого порядка (в 24—28 раз) применяется в настоящее время в стационарных офтальмоскопах с двуступенным увеличением изображения глазного дна. Повышение увеличения при d=2 мм, например с помощью сильного окуляра, не имеет смысла — оно не даст возможности рассмотреть более мелкие детали на глазном дне.
Все это не относится к приборам, в которых изображение проецируется на экран и рассматривается с расстояния, значительно превышающего условное расстояние зрения. Для этих приборов формулой пользоваться нельзя, так как она рассчитана для расстояния 250 мм. Так, например, в телевизионном офтальмоскопе, экран которого наблюдают с расстояния нескольких метров, увеличение, позволяющее рассмотреть мелкие детали, должно быть не меньше 100. Но при этом разрешающая способность, разумеется, не превышает той, которая достигается при обычной офтальмоскопии. В ручных офтальмоскопах при исследовании с медикаментозно расширенным зрачком увеличение не достигает полезного. При разрешающей способности 140—200 линий на 1 мм полезное увеличение, как следует из формулы (51), составляет 25—30, а реальное увеличение — всего около 15. Это означает, что глаз наблюдателя не может использовать возможности прибора. Иными словами, изображение деталей глазного дна получается хотя и резким, но слишком мелким. Отсюда следует, что если к ручному офтальмоскопу пристроить телескопическую систему с двукратным увеличением, то на глазном дне можно будет рассмотреть больше мелких деталей. Такая насадка прилагается к офтальмоскопу фирмы Keeler. Однако наблюдение будет, по-видимому, затруднено вследствие большего влияния движения руки врача. Если же исследование ведется без расширения зрачка и диаметр входного зрачка всего 1,5—2 мм, то увеличение, обеспечиваемое при офтальмоскопии, соответствует разрешающей способности.
—
Статья из книги: Оптические приборы для исследования глаза | Тамарова Р.М.
ЛЕКЦИЯ 25 МИКРОСКОПИЯ
1. Лупа.
2. Оптическая система микроскопа.
3. Увеличение микроскопа.
4. Предел разрешения. Разрешающая способность микроскопа.
5. Полезное увеличение микроскопа.
6. Специальные приемы микроскопии.
7. Основные понятия и формулы.
8. Задачи.
Способность
глаза различать мелкие детали предмета зависит от размеров изображения
на сетчатке или от угла зрения. Для увеличения угла зрения используют
специальные оптические приборы.
25.1. Лупа
Простейшим
оптическим прибором для увеличения угла зрения является лупа,
представляющая собой короткофокусную собирающую линзу (f = 1-10 см).
Рассматриваемый предмет помещают между лупой и ее передним фокусом с
таким расчетом, чтобы его мнимое изображение находилось в пределах
аккомодации для данного глаза. Обычно используют плоскости дальней или
ближней аккомодации. Последний случай предпочтительнее, так как глаз не
утомляется (кольцевая мышца не напряжена).
Сравним углы зрения, под которыми виден предмет, рассматриваемый «невооруженным» нормальным глазом
и с помощью лупы. Расчеты выполним для случая, когда мнимое изображение
предмета получается на бесконечности (дальний предел аккомодации).
При
рассматривании предмета невооруженным глазом (рис. 25.1, а) для
получения максимального угла зрения предмет нужно поместить на
расстояние наилучшего зрения а0. Угол зрения, под которым при этом виден предмет, равен β = В/а0 (В – размер предмета).
При
рассматривании предмета с помощью лупы (рис. 25.1, б) его помещают в
передней фокальной плоскости лупы. При этом глаз видит мнимое
изображение предмета В’, расположенное в бесконечно удаленной плоскости.
Угол зрения, под которым видно изображение, равен β’ ≈ В/f.
Рис. 25.1. Углы зрения: а – невооруженным глазом; б – с помощью лупы: f – фокусное расстояние лупы; N – узловая точка глаза
Увеличение лупы – отношение угла зрения β’, под которым видно изображение предмета в лупе, к углу зрения β, под которым предмет виден «невооруженным» нормальным глазом с расстояния наилучшего зрения:
Увеличения лупы для близорукого и дальнозоркого глаза разные, так как у них различны расстояния наилучшего зрения.
Приведем
без вывода формулу для увеличения, которое дает лупа, используемая
близоруким или дальнозорким глазом при формировании изображения в
плоскости дальней аккомодации:
где адаль – дальний предел аккомодации.
Формула
(25.1) позволяет предположить, что, уменьшая фокусное расстояние лупы,
можно добиться сколь угодно большого увеличения. В принципе это так.
Однако при уменьшении фокусного расстояния лупы и сохранении ее размеров
возникают такие аберрации, которые сводят на нет весь эффект
увеличения. Поэтому однолинзовые лупы обычно имеют 5-7-кратное
увеличение.
Для уменьшения аберраций изготавливают
сложные лупы, состоящие из двух-трех линз. В этом случае удается
добиться 50-кратного увеличения.
25.2. Оптическая система микроскопа
Большее
увеличение можно осуществить, рассматривая при помощи лупы
действительное изображение предмета, создаваемое другой линзой или
системой линз. Такое оптическое устройство реализовано в микроскопе.
Лупу в этом случае называют окуляром, а другую линзу – объективом. Ход лучей в микроскопе показан на рис. 25.2.
Предмет В помещается вблизи переднего фокуса объектива (Fоб) с таким расчетом, чтобы его действительное, увеличенное изображение B’ находилось между окуляром и его передним фокусом. При
Рис. 25.2. Ход лучей в микроскопе.
этом окуляр дает мнимое увеличенное изображение B”, которое и рассматривает глаз.
Изменяя
расстояние между предметом и объективом, добиваются того, чтобы
изображение В” оказалось в плоскости дальней аккомодации глаза (в этом
случае глаз не утомляется). Для человека с нормальным зрением В’
располагается в фокальной плоскости окуляра, а В” получается на
бесконечности.
25.3. Увеличение микроскопа
Основной характеристикой микроскопа является его угловое увеличение. Это понятие аналогично угловому увеличению лупы.
Увеличение микроскопа – отношение угла зрения β’, под которым видно изображение предмета в окуляре, к углу зрения β, под которым предмет виден «невооруженным» глазом с расстояния наилучшего зрения (а0):
25.4. Предел разрешения. Разрешающая способность микроскопа
Может
сложиться впечатление, что, увеличивая оптическую длину тубуса, можно
добиться сколь угодно большого увеличения и, следовательно, рассмотреть
самые мелкие детали предмета.
Однако учет волновых
свойств света показывает, что на размеры мелких деталей, различимых с
помощью микроскопа, накладываются ограничения, связанные с дифракцией света, проходящего через отверстие объектива. Вследствие дифракции изображением освещенной точки оказывается не точка, а небольшой светлый кружок. Если
рассматриваемые детали (точки) предмета расположены достаточно далеко,
то объектив даст их изображения в виде двух отдельных кружков и их можно
различить (рис. 25.3, а). Наименьшему расстоянию между различимыми
точками соответствует «касание» кружков (рис. 25.3, б). Если точки
расположены очень близко, то соответствующие им «кружки» перекрываются и
воспринимаются как один объект (рис. 25.3, в).
Рис. 25.3. Разрешающая способность
Основной характеристикой, показывающей возможности микроскопа в этом отношении, является предел разрешения.
Предел разрешения микроскопа
(Z) – наименьшее расстояние между двумя точками предмета, при котором
они различимы как отдельные объекты (т.е. воспринимаются в микроскопе
как две точки).
Величина, обратная пределу разрешения, называется разрешающей способностью. Чем меньше предел разрешения, тем больше разрешающая способность.
Теоретический предел разрешения микроскопа зависит от длины волны света, используемого для освещения, и от угловой апертуры объектива.
Угловая апертура (u) – угол между крайними лучами светового пучка, входящего в линзу объектива от предмета.
Укажем без вывода формулу для предела разрешения микроскопа в воздушной среде:
где λ – длина волны света, которым освещается объект.
У современных микроскопов угловая апертура достигает 140°. Если принять λ = 0,555 мкм, то получим для предела разрешения значение Z = 0,3 мкм.
25.5. Полезное увеличение микроскопа
Выясним,
насколько большим должно быть увеличение микроскопа при заданном
пределе разрешения его объектива. Примем во внимание, что у глаза
имеется собственный предел разрешения, обусловленный строением сетчатки.
В лекции 24 мы получили следующую оценку для предела разрешения глаза: ZГЛ = 145-290 мкм. Для того чтобы глаз мог различить те же точки, которые разделяет микроскоп, необходимо увеличение
Это увеличение называют полезным увеличением.
Отметим, что при использовании микроскопа для фотографирования объекта в формуле (25.4) вместо ZГЛ следует использовать предел разрешения пленки Z ПЛ.
Полезное увеличение микроскопа –
увеличение, при котором предмет, имеющий размер, равный пределу
разрешения микроскопа, имеет изображение, размер которого равен пределу
разрешения глаза.
Используя полученную выше оценку для предела разрешения микроскопа Zм ≈0,3 мкм), найдем: Гп ~500-1000.
Добиваться
большего значения для увеличения микроскопа не имеет смысла, так как
никаких дополнительных деталей увидеть все равно не удастся.
Полезное увеличение микроскопа – это разумное сочетание разрешающих способностей и микроскопа, и глаза.
25.6. Специальные приемы микроскопии
Специальные приемы микроскопии используются для увеличения разрешающей способности (уменьшения предела разрешения) микроскопа.
1. Иммерсия. В некоторых микроскопах для уменьшения предела разрешения пространство между объективом и предметом заполняют специальной жидкостью – иммерсией. Такой микроскоп называют иммерсионным. Эффект иммерсии заключается в уменьшении длины волны: λ = λ0/n, где λ0 – длина
световой волны в вакууме, а n – показатель преломления иммерсии. В этом
случае предел разрешения микроскопа определяется следующей формулой
(обобщение формулы (25.3)):
Отметим,
что для иммерсионных микроскопов создают специальные объективы, так как
в жидкой среде изменяется фокусное расстояние объектива.
2. УФ-микроскопия. Для уменьшения предела разрешения используют
коротковолновое ультрафиолетовое излучение, невидимое глазом. В
ультрафиолетовых микроскопах микрообъект исследуется в УФлучах (в этом
случае линзы выполняются из кварцевого стекла, а регистрация ведется на
фотопленке или на специальном люминесцентном экране).
3. Измерение размеров микроскопических объектов. С
помощью микроскопа можно определить размеры наблюдаемого объекта. Для
этого применяют окулярный микрометр. Простейший окулярный микрометр
представляет собой круглую стеклянную пластинку, на которой нанесена
шкала с делениями. Микрометр устанавливают в плоскости изображения,
получаемого от объектива. При рассматривании в окуляр изображения
объекта и шкалы сливаются, можно отсчитать, какое расстояние по шкале
соответствует измеряемой величине. Предварительно определяют по
известному объекту цену деления окулярного микрометра.
4. Микропроекция и микрофотография. С
помощью микроскопа можно не только наблюдать объект через окуляр, но и
фотографировать его или проецировать на экран. В этом случае применяют
специальные окуляры, которые и проецируют промежуточное изображение A’B’
на пленку или на экран.
5. Ультрамикроскопия. Микроскоп
позволяет обнаружить частицы, размеры которых лежат за пределами его
разрешения. Этот метод использует косое освещение, благодаря чему
микрочастицы видны как светлые точки на темном фоне, при этом строение
частиц увидеть нельзя, можно только установить факт их наличия.
Теория
показывает, что, как бы силен не был микроскоп, всякий предмет
размерами меньше 3 мкм будет представляться в нем просто как одна точка,
без всяких подробностей. Но это не означает, что такие частицы нельзя
видеть, следить за их движениями или считать их.
Для наблюдения частиц, размеры которых меньше предела разрешения микроскопа, служит приспособление, называемое ультрамикроскоп. Главную
часть ультрамикроскопа составляет сильное осветительное приспособление;
освещенные таким образом частицы наблюдаются в обыкновенном микроскопе.
Ультрамикроскопия основана на том, что мелкие частицы, взвешенные в
жидкости или газе, делаются видимыми при сильном боковом освещении
(вспомним пылинки, видимые в солнечном луче).
25.8. Основные понятия и формулы
Окончание таблицы
25.8. Задачи
1. Линза
с фокусным расстоянием 0,8 см используется в качестве объектива
микроскопа с фокусным расстоянием окуляра, равным 2 см. Оптическая длина
тубуса равна 18 см. Каково увеличение микроскопа?
2. Определить предел разрешения сухого и иммерсионного (n = 1,55) объективов c угловой апертурой u = 140о. Длину волны принять равной 0,555 мкм.
3. Чему равен предел разрешения на длине волны λ = 0,555 мкм, если числовая апертура равна: А1 = 0,25, А2 = 0,65?
4. С
каким показателем преломления следует взять иммерсионную жидкость,
чтобы рассмотреть в микроскопе субклеточный элемент диаметром 0,25 мкм
при наблюдении через оранжевый светофильтр (длина волны 600 нм)?
Апертурный угол микроскопа 70°.
5. На ободке лупы имеется надпись «х10» Определить фокусное расстояние этой лупы.
6. Фокусное расстояние объектива микроскопа f1 = 0,3 см, длина тубуса Δ = 15 см, увеличение Г = 2500. Найти фокусное расстояние F2 окуляра. Расстояние наилучшего зрения a0 = 25 см.